一、羧基微球偶联抗体原理
在多肽中（蛋白、抗体等），伯胺（-NH2 ）存在于每条多肽链的N-末端（称为α-氨基）以及赖氨酸（Lys，K）残基的侧链中（称为ε-氨基）。由于伯胺在生理条件下带正电荷，因此它通常朝外（即，在蛋白质的外表面上），使得其更易于偶联而不会使蛋白质结构改变。羧基微球与抗体的偶联正是利用这一特点，使羧酸（-COOH）与伯胺（-NH2 ）在交联剂的作用下直接偶联，形成微球-抗体偶联物。
EDC和其他碳二亚胺是零长度交联剂。它们使羧酸（-COOH）与伯胺（-NH2 ）直接偶联，而不会成为靶标分子之间最终酰胺键交联的一部分。
因为多肽和蛋白含有多个羧基和氨基，EDC直接介导的交联通常会造成多肽的随机聚合。然而，这一化学反应广泛用于固定化实验中（例如，将蛋白质交联到羧化表面）和免疫原制备中（例如，将小肽交联到大载体蛋白上）。
EDC与羧酸基团反应形成活性O-酰基异脲中间体，该中间体易于被反应混合物中伯氨基团的亲核攻击并取代（图5），伯胺与原始羧基基团从而反应形成一个酰胺键，EDC副产物作为可溶性脲衍生物释放。O-酰基异脲中间体在水溶液中不稳定，其未能与氨基反应会导致中间体水解，再生羧酸基团。
EDC交联在酸性条件下最有效，并且必须在没有外来羧基和氨基的缓冲液中进行。MES等缓冲液（4-吗啉乙磺酸）是一种适宜的碳二亚胺反应缓冲液。磷酸盐缓冲液和中性pH（不超过7.2）条件与化学反应相容，但效率较低。增加反应溶液中 EDC的量可以补偿降低的效率。EDC偶联方案中通常包含N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）或其水溶性类似物（Sulfo-NHS），以提高效率或生成干燥条件下稳定的（氨基反应性）中间体。EDC使NHS与羧基偶联，形成比O-酰基异脲中间体稳定许多的NHS酯，同时允许在生理pH下与伯胺有效偶联。
在EDC反应中添加NHS或Sulfo-NHS（最常用）可提高效率并使分子①活化以供储存和以后使用。
二、缓冲液准备
1、活化缓冲液： 20 mM MES缓冲液，pH=6.5(缓冲体系可根据不同项目进行调整)。
2、交联剂母液：用活化缓冲液分别配制20mg/ml的EDC和Sulfo-NHS（现配现用）。
3、交联/清洗缓冲液：20 mM 硼酸缓冲液，pH=7.0(缓冲体系可根据不同项目进行调整，根据反应情况如有团聚，可添加适量表面活性剂)。
4、封闭剂： 10%(w/v) BSA 溶于20 mM 硼酸缓冲液，pH=7.0。
5、储存缓冲液：20 mM 硼酸缓冲液 pH=8.0 含有 0.1%(w/v) BSA及0.1% Tween 20。
三、偶联微球
1、清洗微球：取50μL（浓度：1μmol/L，粒径：110nm）微球，加入装有500μL活化缓冲液的离心管中。充分混匀后，离心去除上清液（离心条件：4℃，8000Xg，20min）。操作过程中注意避光。2、活化微球：加入500μL活化缓冲液。充分混匀，如发现有团聚现象可进行超声5min处理。分别加入EDC母液和Sulfo-NHS母液各2μL（活化剂使用量根据不同项目进行调整），充分混匀后，在室温下缓慢倾斜旋转孵育反应15min，离心去除上清液（离心条件：4℃，8000Xg，20min）。3、微球-抗体偶联：加入500μL交联/清洗缓冲液。充分混匀，如发现有团聚现象可进行超声5min处理。加入20μg抗体（抗体使用量根据不同项目进行调整），充分混匀后，在室温下缓慢倾斜旋转孵育反应2小时。4、封闭微球：加入55μL封闭剂，充分混匀后，在室温下缓慢倾斜旋转孵育反应30 min。离心去除上清液（离心条件：4℃，8000Xg，20min）。5、清洗偶联物：加入500μL交联/清洗缓冲液。充分混匀，如发现有团聚现象可进行超声5min处理。离心去除上清液（离心条件：4℃，8000Xg，20min）。重复清洗三遍。6、偶联物储存：加入50μL储存缓冲液。根据项目需求进行稀释使用。4℃保存，通常避免冷冻。
